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研究ELISA試劑盒包被和封閉方式分析
更新時(shí)間:2014-06-06   點(diǎn)擊次數(shù):1556次

  ELISA試劑盒抗原或抗體包被時(shí)所用的濃度較低,吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的曠地空閑,封鎖就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些曠地空閑,從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。
    包被用抗原或抗體的濃度,包被的溫度和時(shí)間,包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定。通常在ELISA板孔中加入包被液后,在4-8℃冰箱中放置過(guò)夜,37℃中保溫2小時(shí)被以為具有平等的包被效果。特別是用單抗腹水直接包被時(shí),因其中大量非抗體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面,業(yè)已起到了類(lèi)似封鎖劑的作用。并非所有的ELISA固相均需封鎖,封鎖不當(dāng)反而會(huì)使陰性本底增高。ELISA試劑盒脫脂奶粉也是一種良好的封鎖劑,其zui大的特點(diǎn)是價(jià)廉,可以高濃度使用(5%)。抗體和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液,也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。
  高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封鎖劑使用,但因?yàn)槟谭鄣某煞輳?fù)雜,而且封鎖后的載體不易長(zhǎng)期保留,因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。ELISA試劑盒封鎖的手續(xù)與包被相類(lèi)似。一般說(shuō)來(lái),雙抗體夾心法,只要酶標(biāo)記物是高活性的,操縱時(shí)洗滌*,不經(jīng)封鎖也可得到滿(mǎn)足的結(jié)果。封鎖是否必要,取決于ELISA的模式及詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)前提。

    封鎖(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中,在低溫可保留數(shù)月。ELISA試劑盒包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化,每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。但在間接法測(cè)定中,封鎖一般是不可少的。

    zui常用的封鎖劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白,也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封鎖劑的。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。

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