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如何降低ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)背景的方法
更新時(shí)間:2013-11-18   點(diǎn)擊次數(shù):1577次

        ELISA實(shí)驗(yàn)的原理似乎很簡(jiǎn)單,不外乎固定抗原,添加一抗、二抗和底物,間中夾雜著洗滌和封閉。然而,即使是平淡無(wú)奇的洗滌和封閉,如果做得不太好,也有可能毀了整個(gè)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),我們是否能獲得有意義的信息,這在很大程度上取決于結(jié)果的信噪比。ELISA試劑盒背景噪音會(huì)影響您對(duì)結(jié)果的判斷。如何降低ELISA的背景,下面有一些tips。

洗滌很重要

  洗滌步驟看似很無(wú)聊,其實(shí)很重要,因?yàn)槿绻唇Y(jié)合的材料(如非特異結(jié)合的抗體或檢測(cè)試劑)殘留在微孔板中,那么它會(huì)增加背景噪音。如有必要,可增加洗滌液中的鹽濃度,這會(huì)阻止非特異結(jié)合反應(yīng)。如果背景過(guò)高,而您懷疑洗滌不夠時(shí),可以嘗試增加洗滌次數(shù)。

封閉更關(guān)鍵

  封閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占據(jù)微孔板中潛在的結(jié)合位點(diǎn)。這就降低了可產(chǎn)生信號(hào)的抗體非特異結(jié)合的機(jī)會(huì)。您當(dāng)然也希望抗體只與目的蛋白結(jié)合吧。如果您的背景過(guò)高,懷疑封閉不充分,那么您可以嘗試使用更高濃度的封閉液,或適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間。

如果您一直被背景問(wèn)題所困擾,那么也許您該花些時(shí)間來(lái)優(yōu)化封閉液。這可能需要時(shí)間,但也是值得的。目前主要有兩種類(lèi)型的封閉液:蛋白和非離子型去污劑。您使用的類(lèi)型須取決于多個(gè)因素,包括微孔板的表面試劑、吸附的抗原、您的抗體和檢測(cè)試劑。好的封閉液應(yīng)降低非特異性結(jié)合,但它不應(yīng)當(dāng)與抗原、抗體或檢測(cè)試劑發(fā)生相互作用。

  ELISA實(shí)驗(yàn)zui常用的非離子型去污劑是Tween-20。這種封閉液便宜、穩(wěn)定,在去除洗滌過(guò)程中的一些非特異結(jié)合上很有用。但它們只在存在時(shí)起作用,ELISA試劑盒因?yàn)楹苋菀妆幌吹?。因此所有洗滌液中也必須添加封閉液。請(qǐng)勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%),它會(huì)降低特異結(jié)合,產(chǎn)生假陰性。另一個(gè)選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液,后者可協(xié)助洗滌過(guò)程中的封閉。

  蛋白封閉液則有所不同,是*的。它們與開(kāi)放位點(diǎn)結(jié)合并封閉,同時(shí)穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗原分子。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、正常血清和魚(yú)明膠。血清組分的內(nèi)在多樣性可使它有效攔截許多不同類(lèi)型的分子相互作用。不過(guò),它的缺點(diǎn)在于能與Protein A和IgG抗體相互作用。解決這個(gè)問(wèn)題的一種方法是使用雞或魚(yú)的正常血清。

抗體濃度須優(yōu)化

  ELISA實(shí)驗(yàn)我們通常會(huì)follow師兄師姐留下來(lái)的操作步驟,但是如果試劑稍有不同,則可能需要優(yōu)化抗體的量。記住,非特異的抗體結(jié)合會(huì)增加背景。為了防止這一點(diǎn),切勿使用過(guò)多的一抗或二抗。

檢測(cè)試劑要適量

  另一點(diǎn)也很顯而易見(jiàn):切勿使用過(guò)多的檢測(cè)試劑。如果濃度過(guò)高,或者未正確稀釋?zhuān)瑒t會(huì)導(dǎo)致高背景。也不要顯色過(guò)度,如有必要,優(yōu)化一下何時(shí)應(yīng)加入終止液。

  如果您的ELISA不幸地遇到了高背景,ELISA試劑盒那么也無(wú)需太擔(dān)心,依次查看ELISA系統(tǒng)中的組分,并排除可能存在的問(wèn)題。悉心優(yōu)化,相信很快就會(huì)有漂亮的結(jié)果

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